檔案名稱:faq-oligo.htm

常見問題解答

引子合成


問題1: 為什麼訂購引子用的Excel程式訂購表,經常在輸入文字後(尤其在輸入序列後),無法再進入儲存格修改資料?而且用過後,檔案即被鎖住,無法再次輸入?
問題2: 如何測定引子的OD值?
問題3: 如何檢測引子的純度?
問題4: 要用什麼樣的濃度溶解引子?
問題5: 如何保存引子?
問題6: 已經溶解的引子,為什麼剛溶解時可正常使用,過一段時間後卻無法再次使用?
問題7: 為什麼不能用溴乙烯(EtBr)染色方法對引子定量?
問題8: PCR擴增沒有成功,懷疑是引子不好,怎麼辦?
問題9: 化學合成的引子兩端是磷酸根嗎?
問題10: PCR產物定序後發現引子區域與合成序列不相符合,怎麼辦?
問題11: 可以合成多長的序列?
問題12: 我訂購了兩條可以互補黏合的引子,該以什麼條件來黏合呢?
問題13: 巯基(SH)修飾的引子容易產生二聚體(Dimer),該如何處理?
問題14: 5'-Aminolink的結構式為何?
問題15: 5'-Biotin的結構式為何?
問題16: 為什麼我訂購40nmole合成規模的引子,但以OD值換算後,交貨量卻只有10至20nmole左右?
問題17: 純化或是檢測引子時凝膠電泳(PAGE)的條件為何呢?
問題18: 生工怎麼計算引子的Tm值呢?

問題1 為什麼訂購引子用的Excel程式訂購表,經常在輸入文字後(尤其在輸入序列後), 無法再進入儲存格修改資料?而且用過後,檔案即被鎖住,無法再次輸入?
解答

因檔案前十列為標題與訂單資料區,設定有防修改保護,您並不需更動或修改此一部份;第十一列起為引子資料輸入區,係供客戶輸入引子資料使用,本公司並未設定任何保護或功能鎖定,您應可自由編輯輸入資料。

您在網站上下載Excel訂購表後,我們建議您立即開啟此一檔案填入實驗室相關資訊存檔備用,日後訂購時即以此檔為範本,填入欲訂購之引子資料後另存新檔,請盡量避免於舊有之訂單檔案上修改資料。

另外,如果您的ID或序列資料是由Word或其他程式轉貼過來,資料貼入後儲存格將被鎖住。您可以在選取儲存格後,將資料貼在上方的資料編輯列中(打叉及打勾的位置右邊),即可避免儲存格被鎖住。

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問題2 如何測定引子的OD值?
解答

以紫外光分光光度計測定溶液260nm波長的光密度來定量,測定時溶液的光密度最好稀釋為0.2至0.8之間。

DNA乾燥粉末用一定體積的水充分振蕩溶解以後,取部分溶液稀釋到1mL,並在1mL標準石英比色管中測定其光密度,即為所測體積的OD值,進而可以計算出原液的OD值。

例如您拿到一管乾燥的DNA,用1mL水溶解成原液,取該原液50uL稀釋成1mL並在1mL標準石英比色管中測得光密度0.25,說明該50uL中含有0.25OD的DNA,也即說明原來1mL原液中含有5OD的DNA。

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問題3 如何檢測引子的純度?
解答

實驗室最方便的作法是以聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)檢測:使用加有7M尿素的16%聚丙烯醯胺凝膠進行電泳。

請取0.2-0.5OD的引子,以尿素飽和液溶解或在引子溶液中加入乾燥尿素直到飽和為止,並於電泳上樣前先加熱變性(95度,2分鐘)。加入尿素的目的,一是變性,二是增加樣品比重,容易上樣。

隨後以600V電壓進行電泳,一定時間後(約2-3小時),即可打開玻璃板,以螢光TLC片在紫外光燈下檢測。如在主條帶之下沒有雜帶,即可證明純度沒有問題。(變性不充分時,主條帶之上可能會有其他條帶,此為引子二級結構條帶,變性完全時即消失。)

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問題4 要用什麼樣的濃度溶解引子?
解答

您可以根據下列參數換算:
1OD乾燥引子的質量約為33ug
引子的莫爾數 = 質量 / 分子量

例如:
一管標明為5OD的引子
分子量為6490
引子質量 = 5 x 33 = 165ug
引子的莫爾數 = 165 / 6490 = 0.025umol = 25nmol
若您需要將此管引子溶解為25uM的溶液,您只需加入1mL的二次水充分溶解即可。

另有一點請您注意,真空乾燥的引子呈薄膜狀或粉末狀吸附在離心管底部,請小心開蓋,以避免逸失。溶解時,請加入足量的水充分振蕩溶解。

隨引子交給您的分析資料中,已將幾個您可能會用到的換算數值為您算好,計算前請先參考該資料。

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問題5 如何保存引子?
解答 我們提供的乾燥引子係由有機溶劑中抽乾燥取得,無菌,無核酸脢活性。可於室溫或-20℃長期密閉保存。溶解後的引子應保存於-20℃,引子溶解用水的pH應大於7且無菌。帶有螢光標記的引子保存時,請注意避光。

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問題6 已經溶解的引子,為什麼剛溶解時可正常使用,過一段時間後卻無法再次使用?
解答 如果您溶解引子用的水pH過低,或是遭菌或核酸脢污染,將使引子降解。冷凍引子從冰箱拿出時,未充分解凍並振蕩混合均勻,也可能造成引子加入量不準確,造成實驗失敗。

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問題7 為什麼不能用溴乙烯(EtBr)染色方法對引子定量?
解答 溴乙烯可與雙股DNA嵌合,故僅適於用來對雙股DNA(如Plasmid DNA)概略定量。化學合成之引子為單股DNA,在變性條件下,不會嵌合溴乙烯;而在一般狀況下,溴乙烯可與引子二級結構中的雙股區域產生嵌合。由於鹼基組成不同,引子形成的二級結構也可能不同,嵌合溴乙烯的量也不同。例如Oligo(dT)等不會形成二級結構的引子,溴乙烯根本無法染色。您如需要對單股的引子定量,建議您使用紫外光分光光度計檢測。

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問題8 PCR擴增沒有成功,懷疑是引子不好,怎麼辦?
解答 PCR擴增不成功的因素很多,需要您耐心地分析,建議您在實驗時設置對照組來判定原因。如果您懷疑是引子的問題,請您先測定引子的OD值,以確認實驗時加入的引子量是否正確。如果引子加量正確,請將您的引子編號及Oligo ID提供給我們,我們會複查留存樣品,並免費為您重新合成。重新合成後如果仍然不能擴增,應可排除是來自於引子的問題,請由其他方面著手。

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問題9 化學合成的引子兩端是磷酸根嗎?
解答 化學合成的引子兩端都是羥基(-OH),可直接用於PCR。如果需要,您可以磷酸脢(Kinase)自行磷酸化。也可以由我們在合成時直接於5'或3'端進行磷酸化,但您必需另外付費

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問題10 PCR產物選殖定序後發現引子區域序列不正確,為什麼會這樣?我該怎麼辦呢?
解答

關於引子序列變異的問題,Invitrogen公司在其網頁(瀏覽該網頁時,地區設定請選擇美國,臺灣地區無法瀏覽此一網頁。您如無法瀏覽,亦可參考我們於98年9月18日擷取之頁庫存檔。)上有完整的說明。基本上,定序後發現的引子突變來源可以大概區分為化學合成與生物複製兩類。對於化學合成階段引入的序列錯誤,尤其是鹼基缺失,目前最為廣泛採用的檢測方式為質譜分子量鑑定。如您有此疑慮,生工亦提供質譜分子量收費檢測,您可在訂購引子時依需選用,相關收費細節,歡迎來電本公司洽詢。

當您定序後發現引子區域序列不正確時,您可以:
1.通知我們免費重新合成引子。我們也會對您原始引子的留樣與重合的引子進行質譜檢測。一般來說,您的引子留樣我們會為您保存三個月。
2.重新挑取菌盤中的其他菌落定序。

選殖基因時,請盡量使用Pfu及經質譜檢測的引子來擴增,可提高準確度。根據我們的經驗,您設計的引子如在5'端留有未能與模版配對之脢切延長端,受引子的不穩定二級結構(unstable stem loop structures)影響,即使質譜分子量檢測正常,仍有較高的機會發生引子序列變異。

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問題11 可以合成多長的序列?
解答 我們經常合成長度大於100鹼基的引子,目前合成長度紀錄為120鹼基。您如需要長於120鹼基之引子,歡迎來電洽詢。訂購長引子前,別忘了先參考生工全基因合成替代方案喔。

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問題12 我訂購了兩條可以互補黏合的引子,該以什麼條件來黏合呢?
解答

您可以使用下列任一條件來黏合兩股單股的引子。

1.將引子以黏合緩衝液(10mM Tris, pH 7.5-8.0, 50mM NaCl, 1mM EDTA)溶解,建議引子濃度為50-100uM,總體積小於500uL。溶解後在95℃加熱2分鐘,隨後慢慢冷卻至室溫即可。對有可能產生髮夾結構(Hairpin Loop)的引子,可採用更為緩慢的冷卻方式,即將保溫後的樣品置於停止加熱的水浴中緩慢冷卻,產物即為穩定的雙股DNA,可以放在4℃備用。

2.引子濃度大於0.1OD/10uL,NaCl濃度大於0.1M,以100℃煮沸5分鐘後,自然冷卻至室溫。

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問題13 巯基(SH)修飾的引子容易產生二聚體(Dimer),該如何處理?
解答 巯基易因氧化而產生-S=S-二聚體,您可以使用DTT(100mM, pH 8.3-8.5)室溫處理30分鐘,即可解決此一問題。

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問題14 5'-Aminolink的結構式為何?
解答

結構式如下:

3'端結構稍有不同,但有效部分H2N(CH2)6是完全一樣的。

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問題15 5'-Biotin的結構式為何?
解答

結構式如下:

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問題16 為什麼我訂購合成規模40nmole的引子,但以OD值換算後,交貨量卻只有10至20nmole左右?
解答 40nmole、200nmole與1umole等合成規模是指引子合成時,合成儀的加藥量。但因化學合成時,反應效率並非百分之百,且有累積性。因此最終產量會較合成規模為低。一般20鹼基的引子,40nmole合成規模得到的產量約為5OD,換算為莫爾數約為15至25nmole;PAGE純化後產量2OD,約為5至10nmole。

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問題17 純化或是檢測引子時凝膠電泳(PAGE)的條件為何呢?
解答 7M Urea Solution
16% Polyacrylamide Gel
500-600 V
25mA

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問題18 生工怎麼計算引子的Tm值呢?
解答 生工依照美國西北大學網頁www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html#helpbasic上的Basic Melting Temperature (Tm) Calculations公式計算引子的Tm值。該網頁上另有許多引子性質的分析工具,您也可以多加利用。

採購找生工,預算最輕鬆。