檔案名稱：faq-pep.htm
常見問題解答
短肽合成
問題：短肽合成的基本原理？
解答：短肽固相合成法是短肽合成化學的一個重大的突破。它的最大特點是不必純化中間產物，合成過程可以連續進行，進而為短肽合成的自動化奠定了基礎。目前短肽的全自動合成，基本上都是固相合成。其基本過程為： 以Fmoc化學合成為基礎，先將所要合成的目標短肽之C端氨基酸的羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然後以這一氨基酸的氨基作為短肽合成的起點，與其他的氨基酸已活化的羧基作用形成肽鍵，不斷重複此一過程，即可得到短肽。根據短肽的氨基酸組成不同，短肽後處理方式也不同，純化方式也有差異。
問題：做免疫用的短肽以多少殘基為宜？
解答：一般以10至15個氨基酸殘基為宜。較長的短肽免疫效果更好，不過合成費用也會增加。八分枝多重抗原（MAP）短肽則希望長度在15殘基以上，效果較好。另外，10殘基以下的短肽免疫效果較差。
問題：免疫用短肽的純度要求很高嗎？
解答：一般而言，免疫用短肽的純度在70%至85%之間即可。
問題：我們合成的短肽溶解性不好，這意味著短肽有問題，對嗎？
解答：一個短肽的溶解性及合適的溶劑很難準確預測。如果短肽難以溶解就認為短肽合成有問題，這個觀念並不正確。
問題：合成的短肽狀態如何?如何保存？
解答：我們提供的短肽是粉末狀，一般為灰白色。組成不同，短肽粉末的顏色也有差異。短肽長期保存必需避光，並應保存在-20℃；短期可以保存在4度。短時間亦可以室溫運輸。
問題：如何溶解短肽？
解答：溶解短肽是非常複雜的事情，很難一下子確定合適的溶劑。通常是先取一小部分溶解測試，在未確定合適的溶劑之前，絕對不可以合部溶解。
下列方法有助於您選擇合適的溶劑：
(1)判定短肽的電荷特定。設定酸性氨基酸Asp(D)、Glu(E)和C端COOH為-1；鹼性氨基酸Lys(K)、Arg(R)、His(H)及N端NH2為+1，其他氨基酸的電荷為0。並將所有氨基酸殘基之電荷加總。
(2)如果淨電荷數＞0，短肽為鹼性，用水溶解。如果不溶解或溶解性不大，加入醋酸(10%以上)。如果還不能溶解，可加入少量TFA(25uL)溶解，隨後再加入500uL水稀釋。
(3)如果淨電荷數＜0，短肽為酸性，用水溶解。如果不溶解或溶解性不大，加入氨水(25uL)溶解，隨後再加入500uL水稀釋。
(4)如果淨電荷數＝0，短肽為中性，可能需要用有機溶劑如乙腈、甲醇、異丙醇或DMSO等溶解。也可以試著以尿素來溶解疏水性很大的短肽。
問題：非HPLC純化的短肽中含有哪些雜質？
解答：粗品和脫鹽級別的短肽中會有短肽與非短肽類雜質，如非全長短肽及短肽後處理的一些原料，如DTT、TFA等。
問題：經HPLC純化的短肽中含有哪些雜質？
解答：經過HPLC純化的短肽，仍會有些許雜質存在，其中的雜質主要為短肽和微量TFA。
問題：多長的短肽為合適？
解答：短肽合成必需考慮短肽的長度、電荷與親疏水性等因素。長度越長，合成粗品的純度和產率都會隨著降低，純化的難度和合成失敗的機率就會大些。當然，短肽功能區的序列是無法改變的，但是為了短肽的順利合成，有時不得不在功能區的上下游增加一些輔助氨基酸，以改善短肽的溶解性和親疏水性。如果短肽太短，合成也可能會有問題，主要問題是合成的短肽在後處理過程中有一定的難度。5個殘基以下的短肽，一般要有疏水的氨基酸，否則後處理難度很大。15個氨基酸殘基以下的短肽一般都可以得到滿意的產率和得率。
問題：如何從短肽序列中判定短肽的溶解度？
解答：
(1)如果短肽中含有高比例的強疏水性氨基酸，如Leu、Val、IIe、Met、Phe和Trp，這類短肽很難溶解於水性溶液，或根本無法溶解。這些氨基酸無論是純化或合成，都可能有問題。
(2)一般情況下，如果疏水性氨基酸的比例＜50%，無連續5個疏水性氨基酸殘基，且帶電荷（正電荷：K、R、H與N端；負電荷：D、E與C端）的氨基酸比例達到20%，這類短肽較易溶解。在短肽的N或C端如果能增加極性氨基酸，也可以增加溶解度。
問題：為什麼含有Cys、Met或Trp的短肽難合成？
解答：含有Cys、Met或Trp的短肽難以合成，也難以得到高純度的產品。主要原因為這些氨基酸含有不穩定基團，易氧化。這類短肽的使用和儲存都需要特別注意，避免反覆開啟蓋子。
問題：為什麼某些短肽的合成產率或純度會比較低？
解答：短肽合成與引子合成有比較大的區別，不能合成的引子很少，但是不能合成的短肽卻經常有。如Val、Ile、Tyr、Phe、Trp、Leu、Gln和Thr這些氨基酸比鄰或重複時，短肽鏈在合成過程中不能完全舒展溶解，合成效率即受影響而下降。以下幾種情形，合成效率和產物的純度都比較低，如重複的Pro、比鄰的Ser、重複Asp與4個連續Gly等。
問題：短肽如何純化？
解答：短肽純化一般以反相柱純化，緩衝體系通常為A液（0.1% TFA in Water, pH 2.0）與B液（1% TFA in ACN, pH 2.0）。短肽純化前先以A液溶解，如果溶解性不好，先以B液溶解後，再以A液稀釋。對疏水性強的短肽，有時還需加入少量的Formic酸或醋酸。以HPLC分析短肽粗產物時，如果短肽不長（15殘基以下），一般會有主峰，主峰通常即為全長產物。對於20殘基以上的長肽，如果沒有主峰，必需搭配質譜分析來判定分子量，進而確定哪個峰才是所要合成的短肽。
採購找生工，預算最輕鬆。
中華民國95年07月13日更新