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知識分享

  • 選擇什麼方法純化Oligo?
  • 化學合成之Oligo在分子生物學研究、臨床診斷和藥物治療方面均日形重要,故而對於實驗成功與否,選擇適當的方法純化Oligo其實是十分關鍵的因素。

    壹、為什麼要純化?

    化學合成Oligo,其有機化學原理是利用結合於固相載體(CPG)上的核甘酸作為3'端第一個核甘酸與另一個受保護的去氧核甘酸在催化劑催化下進行縮合反應,隨後在氧化脫去5'端保護基DMT後,再與第三個受保護的去氧核甘酸縮合,如此循環達到合成Oligo之目的,縮合合成結束後再利用氨解方法脫去Oligo上之保護基。一般A、C鹼基通常採用苯甲醯基保護,G鹼基採用異丁醯基保護,亞磷酸採用氰乙基保護,T鹼基則不保護。目前固相合成Oligo均在DNA合成儀上進行。前述方法合成之Oligo在氨解脫去保護基後含有大量雜質,純度極低。其主要雜質為脫下的保護基與氨形成的苯甲酸氨和異丁酸氨以及氰磷基上脫下的氰乙基等,以致粗產物中Oligo含量僅約15%左右。粗產物中另一雜質則為合成時產生的短鏈。儘管目前合成方法的每一次縮合反應效率均可達97%以上,但累積效率並不高。以長度為20鹼基和50鹼基之Oligo為例,97.5%的二十次方約為60%,97.5%的五十次方則只有28%。因此,在粗產物中目標Oligo的含量甚至連10%都不到。前述雜質,尤其是存在於粗產物中的大量短鏈與鹽,不但造成定量不準確,而且有礙下一步的反應,故而Oligo的純化並不是可有可無的步驟,而是必不可少的工作。

    貳、選擇什麼方法純化Oligo?

    近年來,合成Oligo的儀器確實有了很大的進步,但其成就主要集中在成功率提升與試劑消耗降低等方面,從化學合成原理上來看,粗產物中大量短鏈與鹽的存在仍然無法避免。雖然未經純化的Oligo仍能用於一般PCR反應,但成功率較低。一般來說,除用戶特別要求外,代為合成Oligo的公司大多不提供未經純化之Oligo粗產物,其純化Oligo的方法約可歸納為下列四類:

    1. 脫鹽:常用的方法有下述三種

    A. 酒精沉澱。粗產物中的氨鹽等雜質可溶於酒精,而Oligo在適當鹽濃度下不溶於酒精。此一方法脫鹽十分簡便,但回收產率較低,尤其是較短的Oligo。大多數Oligo合成公司採用此法脫鹽。

    B. 分子篩。粗產物中的鹽可利用Oligo和鹽分子量的差別而分離,但此一方法操作複雜,並不理想。

    C. RPC柱。反相柱脫鹽方法是較理想的脫鹽方法,其原理是利用Oligo可專一性地吸附於RPC柱上而達到脫鹽目的。

    2. OPC柱純化

    OPC柱純化Oligo的原理是利用保留於5'端的DMT保護基可專一性地吸附於OPC柱上,而短鏈Oligo由於沒有DMT保護基,不易被OPC柱吸附,從而達到脫鹽純化的目的。使用此一方法純化之Oligo適用於一般PCR或要求較高之PCR反應。但使用此一方法純化之Oligo常混有少一到二個鹼基之短鏈,因此並不適於基因合成和DNA定序之用,另外此一方法亦不適於純化大於40個鹼基之Oligo,產率較低。

    3. HPLC純化

    HPLC純化方法和OPC柱純化方法在原理上頗為接近,也是利用5'端DMT保護基與其他不帶保護基的Oligo在管柱上吸附能力不同達成分離純化的目的,然而由於採用HPLC儀器,其純化效果優於OPC柱純化。只要Oligo長度不超過40個鹼基,用HPLC純化的Oligo可用於PCR反應、基因合成和DNA定序。但HPLC方法不適於純化超過40個鹼基之Oligo,在此狀況下,雖然目標Oligo帶有5'端DMT保護基,其與不帶DMT保護基的短鏈在管柱上之吸附能力差異不大,因此分辨率降低,純化之Oligo常含有缺少幾個鹼基的短鏈。此外,本法對G鹼基較多之Oligo也不適用。若採用本法純化已脫去DMT保護基之Oligo,由於其留置時間僅反映其表面疏水性,不易用以判斷Oligo之長短。

    4. PAGE純化

    聚丙烯醯氨凝膠電泳(PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, PAGE)是利用電場作用下Oligo泳動速率差異分離純化樣品。由於同時利用靜電作用與分子篩效應,並可採取提高分辨率的變性手段,PAGE方法具有極高之分辨率,長度僅相差0.2%(即500個鹼基中的1個鹼基)的DNA分子即可分辨。從凝膠中回收的DNA純度很高,可適用於要求最高的實驗。PAGE純化方法是純化效果最佳的方法,使用此一方法純化的Oligo可用於任何分子生物學實驗,包括PCR反應、基因合成和DNA定序等。PAGE純化對於Oligo長度幾乎沒有限制,即使長達上百個鹼基之Oligo也能清楚分辨幾個鹼基的差異。

    雖然PAGE純化之效果最佳,但一般很少採用此一方法純化。其主要原因為此一方法非常費時、費人工,並有毒害,因此十分昂貴。一般採用此法純化一股Oligo,除基本費用外,仍需加收800至1200元純化費,以往許多實驗室只在進行少數要求較高實驗,如基因合成和DNA定序時採用此一方法。但在需要大量高品質Oligo進行實驗時,採用此法顯然成本過高。生工公司為協助研究單位能以有限的經費完成更高水準的實驗,經與國外合作廠商反覆協調,終於爭取到約為市面行情1/3之PAGE純化價格,希望能讓研究單位有更多的機會採用此一效果最佳的純化方法。生工公司國外合作廠商目前推出之PAGE純化方案結合PAGE與RPC柱純化,先用PAGE純化去除短鏈Oligo,再用RPC柱純化,效果優於其他公司採用之單一PAGE純化。