檔案名稱：faq-RNA.htm
常見問題解答
RNA及siRNA
| 問題：1 | 生工公司提供的是雙鏈還是單鏈的siRNA呢？ |
| 問題：2 | 請貴公司合成siRNA時需要提供什麼資料？貴公司可以免費設計siRNA嗎？ |
| 問題：3 | 如何選擇siRNA懸垂的序列組成？ |
| 問題：4 | 針對人類基因設計的siRNA對其他物種是否也有效？ |
| 問題：5 | 生工公司提供的siRNA是怎樣包裝運送的？如果在常溫下放置了一個星期，還有效嗎？ |
| 問題：6 | 在體外實驗中，需要多少量的siRNA？ |
| 問題：7 | 我用100nM的siRNA轉染時只得到50%的抑制效率，我可以把siRNA的濃度增加到200nM甚至400nM嗎？ |
| 問題：8 | 一定需要陰性對照嗎？ |
| 問題：9 | 常用的陰性對照有哪些類型？ |
| 問題：10 | 在陰性對照體系和實驗體系中均觀察到同樣的實驗結果，這是什麼原因？ |
| 問題：11 | 為什麼陽性對照在RNA干擾實驗中很重要？ |
| 問題：12 | 用於對照的siRNA最佳濃度是多少？ |
| 問題：13 | 螢光標記siRNA適於作為對照使用嗎？如何檢測螢光標記siRNA？ |
| 問題：14 | FAM的最大吸收和發射各在哪個波長？ |
| 問題：15 | 如何選擇轉染試劑？ |
| 問題：16 | 轉染過程中發現細胞大量死亡，應該如何處理？ |
| 問題：17 | 如何將siRNA轉染入細胞內？ |
| 問題：18 | 我剛剛開始接觸RNA干擾技術，從文獻上看，不同細胞應該選用不同的轉染試劑，不同的研究目的，應該使用不同的siRNA。我的經費有限，如何決定我的研究體系？ |
| 問題：19 | 如果計劃使用RT-PCR檢測基因抑制效果，應該注意哪些問題？ |
| 問題：20 | 開始體內實驗前需要注意什麼問題？ |
| 問題：21 | 在體內研究中，最好的給藥途徑是什麼？給藥頻率是多少？ |
| 問題：22 | 小鼠體內實驗需要多少siRNA？ |
| 問題：23 | 抑制效果不理想，應該如何處理？ |
| 問題1 | 生工公司提供的是雙鏈還是單鏈的siRNA呢？ |
| 解答 | 生工公司提供的siRNA是雙鏈Duplex，我們的售價也是以雙鏈Duplex交貨規格來定價。 |
| 問題2 | 請貴公司合成siRNA時需要提供什麼資料？貴公司可以免費設計siRNA嗎？ |
| 解答 | 訂購siRNA時，請您提供該siRNA的19個核苷酸序列。您也可以提供基因的GeneID或者Accession Number，由生工公司為您免費設計。 |
| 問題3 | 如何選擇siRNA懸垂的序列組成？ |
| 解答 | 您可以自行選擇懸垂的序列組成。近期的研究顯示懸垂的組成在mRNA目標區域識別和酶降解中並不重要，懸垂可能在形成RISC的過程中起結構的作用。許多研究人員選擇dTdT是因為研究顯示脫氧核糖核苷能保護siRNA免受酶降解。合成siRNA時最重要的是確定目標mRNA的19個鹼基核心結構。 |
| 問題4 | 針對人類基因設計的siRNA對其他物種是否也有效？ |
| 解答 | 一般siRNA都具有物種特異性，很少與其他物種有相同的目標位點，所以針對人類基因設計的siRNA不會抑制其他物種的同源序列。然而，也有研究顯示siRNA經過特異性設計後能對兩個或兩個以上的物種有效，這需要仔細進行siRNA設計和生物資訊學分析。 |
| 問題5 | 生工公司提供的siRNA是怎樣包裝運送的？如果在常溫下放置了一個星期，還有效嗎？ |
| 解答 | 生工公司為您提供的siRNA是凍乾粉末，可在常溫下運輸。這些凍乾的產品在室溫下能穩定保存2至4個星期，所以放置一個星期不會影響其實驗效果。但我們建議您收到樣品後最好保存於-20℃或-70℃冰箱中。 |
| 問題6 | 在體外實驗中，需要多少量的siRNA？ |
| 解答 | 我們建議您用於實驗的siRNA濃度為100nM。1nmole的siRNA對於一個24孔板或是96孔板的實驗即已足夠。 |
| 問題7 | 我用100nM的siRNA轉染時只得到50%的抑制效率，我可以把siRNA的濃度增加到200nM甚至400nM嗎？ |
| 增加siRNA的濃度一般不能提升抑制效率。高濃度的siRNA將可能導致非特異作用以及對細胞的毒性。siRNA的高抑制效率來自於合理的設計，在100nM甚至更低的濃度都可能有75%的沉默效率。另外，低轉染效率也會導致低抑制效率，對siRNA的轉染條件進一步優化也是另一可以考慮的方向。 |
| 問題8 | 一定需要陰性對照嗎？ |
| 解答 | 是，陰性對照是RNA干擾實驗中不可缺少的。由於在超過200nM的濃度下，siRNA有可能會導致非特異性的壓力反應，所以在實驗體系中必需設置陰性對照。它能夠幫助我們確認基因表達水平的降低是否是序列特異性的RNA干擾結果。由於siRNA的合成方法及轉染試劑等因素都有可能導致廣泛的基因抑制現象，如果沒有陰性對照，研究人員很可能誤將廣泛性且非特異性的基因抑制解釋為由RNA干擾所引起的基因特異性抑制。 |
| 問題9 | 常用的陰性對照有哪些類型？ |
| 解答 | 常用的陰性對照大體分為兩種：一種是使用通用陰性對照，該對照序列已被上千篇研究論文使用；另一類是使用與實驗用siRNA序列組成相同但序列打亂的siRNA作為陰性對照。第二類陰性對照和通用序列相比較，一方面價格較高，另一方面，由於打亂後的序列並未經過序列驗證，有可能會產生非目標區抑制。因此，除非有非常特殊的要求，最好使用通用序列作為陰性對照。 |
| 問題10 | 在陰性對照體系和實驗體系中均觀察到同樣的實驗結果，這是什麼原因？ |
| 解答 | 這樣的結果充分說明了設置陰性對照的必要性。該結果說明您所觀察到的結果不是序列特異性抑制的結果，您必需降低siRNA的工作濃度。 |
| 問題11 | 為什麼陽性對照在RNA干擾實驗中很重要？ |
| 解答 | 以陽性對照驗證一個實驗系統的可靠性非常重要。也就是說，當您看到siRNA陽性對照的預期實驗結果時，您才能確保在您的實驗方法中，您的轉染、RNA抽取和檢測等方法都是可靠的。通常最好的陽性對照是內在的對照。 |
| 問題12 | 用於對照的siRNA最佳濃度是多少？ |
| 解答 | 陽性對照和陰性對照的siRNA濃度都應該與實驗組的siRNA濃度相同。 |
| 問題13 | 螢光標記siRNA適於作為對照使用嗎？要如何檢測螢光標記siRNA？ |
| 解答 | 已有不少實驗室研究過螢光標記siRNA的螢光檢測結果與抑制效率之間的相關性。螢光標記siRNA是最常用來優化轉染條件的方法。您可以用流式細胞儀或者螢光共軛顯微鏡檢測螢光標記siRNA。 |
| 問題14 | FAM的最大激發和放射各在哪個波長？ |
| 解答 | 最大激發位於494nm，最大放射位於518nm。 |
| 問題15 | 如何選擇轉染試劑？ |
| 解答 | 好的轉染試劑有以下特點： 1、對siRNA有較高的轉染率。 2、對細胞的毒性小。 |
| 問題16 | 轉染過程中發現細胞大量死亡，應該如何處理？ |
| 解答 |
如果出現細胞大量死亡，意味著您的轉染條件仍然需要優化，轉染條件的優化一般包括以下幾個方面： 如果同一管轉染試劑在不同實驗中對細胞的毒性存在差異，一般應是實驗過程本身帶來的差異。如果已經做了以上幾項工作，轉染效率仍然得不到提高，建議您更換另一種轉染試劑。 |
| 問題17 | 如何將siRNA轉染入細胞內？ |
| 解答 | 使用什麼樣的轉染方法，大致上取決於您所使用的細胞系： 1.貼壁的、易轉染的細胞，推薦使用生工RNAi-mate轉染試劑。 2.懸浮的或原代的細胞，推薦使用電擊轉化方法。 3.電擊轉化效率仍然很低的細胞，請使用載體系統。 |
| 問題18 | 我剛剛開始接觸RNA干擾技術，從文獻上看，不同細胞應該選用不同的轉染試劑，不同的研究目的，應該使用不同的siRNA。我的經費有限，如何決定我的研究體系？ |
| 解答 | 在開始RNA干擾研究之初，您必需先確定使用化學合成siRNA還是使用載體構建shRNA？我們建議您先以化學合成的方法來篩選有效的siRNA片段，然後把您篩選出來的siRNA片段插入到載體中進行抗性篩選，得到穩定表達的細胞株後，再做長期研究。 |
| 問題19 | 如果計劃使用RT-PCR檢測基因抑制效果，應該注意哪些問題？ |
| 解答 | 我們推薦RT-PCR的引子應該設計在目標位置的兩側，而不是同側。目前已知由siRNA誘導的基因抑制機制是RSIC先誘導目標mRNA的切割，切割導致目標mRNA的降解。由於切割和降解可能在不同的時點發生，設計於同側的PCR引子可能導致假陰性結果或抑制效率的低估。另外，RT-PCR結果會因為目標基因mRNA降解時間不同、細胞內目標基因mRNA豐度不同而導致假陰性結果。特別對於豐度較高的基因，推薦使用的檢測方式包括定量PCR、Northern Blot檢測、Western Blot檢測等。 |
| 問題20 | 開始體內實驗前需要注意什麼問題？ |
| 解答 | 體內實驗設計包含動物模型的選擇、給藥途徑、劑量和給藥次數等等。siRNA使用的數量及濃度主要取決於目標點的性質，諸如腫瘤的類型、組織的類型、靶基因表達水平與動物模型個體大小等等，針對不同的研究模型，最好先查閱相關資料。 |
| 問題21 | 在體內研究中，最好的給藥途徑是什麼？給藥頻率是多少？ |
| 解答 | 寡核苷酸可以通過大劑量給藥或使用ALZET微小泵持續給藥。大劑量給藥時要慎重，因為已有研究顯示某些毒性與反義寡核苷酸的濃度有關，快速給藥時可能會導致動物下肢癱瘓或致死，所以給藥時要注意觀察。很多已發表的論文實驗經由尾靜脈給藥。任何給藥方式都需要優化，以確保最佳的導入方式和動物的健康。以靜脈注射為例，每天注射一到兩次，連續注射一到兩周。 |
| 問題22 | 小鼠體內實驗需要多少siRNA？ |
| 解答 | 迄今為止，還沒有明確的siRNA體內實驗使用量計算公式。在實驗前最好先從文獻中查詢是否已經有相關的論文發表。對於常規實驗，一般使用100uL的注射體積，濃度為10到500uM。早期反義寡核苷酸的研究顯示，當每日劑量大於20mg/kg時可以觀察到明顯的毒性。建議您針對您的實驗繪製劑量反應曲線。一般情況下，每日給藥劑量可以5mg/kg作為優化起點。需要注意的是，這個劑量只是一個預實驗的起點，最後的給藥劑量取決於動物模型、目標基因、目標組織和給藥方式等因素。 |
| 問題23 | 抑制效果不理想，應該如何處理？ |
| 解答 | 影響抑制效果最常見的兩個原因是轉染效率低和siRNA序列設計不理想。如果您初次使用siRNA或採用了新的細胞系，並發現抑制效果不佳，我們建議您對轉染效率進行檢測，並選擇優化轉染條件。如果您已經對轉染條件進行優化但是問題依然存在，我們建議您換用另一種轉染試劑或是採用其他技術，這也許能提高轉染效率。如果已經提高了轉染效率但是抑制效果仍然未達要求，可能是因為siRNA序列設計的效果不理想，請設計新的siRNA。 |
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